BIOKIMIA 5 (ENZIM 3) STKIP MUHAMMADIYAH SORONG

3.1. Pembentukan sebuah Kompleks Substrat Enzim adalah Langkah Pertama di Katalisis enzimatik

Sebagian besar daya katalitik enzim berasal dari substratnya yang membawa bersama-sama dalam orientasi mendukung bagi promosi pembentukan keadaan-keadaana transisi enzim-substrat (ES) kompleks. Substrat yang terikat untuk daerah enzim tertentu yang disebut situs aktif. Kebanyakan enzim sangat selektif dalam substrat yang mereka ikat. Memang, kekhususan katalitik enzim tergantung sebagian pada spesifisitas pola mengikat. Bukti untuk keberadaan sebuah kompleks enzim-substrat?

1. Petunjuk pertama adalah pengamatan bahwa, pada konsentrasi enzim konstan, laju reaksi meningkat dengan peningkatan konsentrasi substrat sampai kecepatan maksimal tercapai (Gambar. 4). Sebaliknya, reaksi uncatalyzed yang lakukan tidak menunjukkan efek saturasi. Fakta bahwa reaksi enzim-katalisasi memiliki kecepatan maksimal menunjukkan pembentukan kompleks diskrit ES. Pada konsentrasi substrat cukup tinggi, semua situs katalitik diisi sehinggalaju reaksi tidak dapat meningkat. Meskipun tidak langsung, ini adalah bukti yang paling umum untuk keberadaan kompleks ES.

Gambar. 4. Kecepatan Reaksi Versus Konsentrasi Substrat dalam Reaksi Enzim-Dikatalisis. Reaksi Enzim-Dikatalisis mencapai kecepatan maksimal.

I. The Molecular Design of Life 8. Enzymes: Basic Concepts and Kinetics 8.3. Enzymes Accelerate Reactions by Facilitating the Formation of the Transition State

2. Kristalografi X-ray telah membuktikan dengan hasil resolusi yang tinggi gambar analog substrat dan substrat terikat pada situs aktif dari banyak enzim (Gambar. 5). Substrat analog dapat diubah menjadi cahaya substrat, dan gambar dari subtract enzim yang kompleks diperoleh dalam sepersekian detik dengan men-scan kristal, polikromatik x-ray dari sinkrotron.

Gambar. 5. Struktur dari sebuah Kompleks Enzim-Substrat. (Kiri) Enzim sitokrom P-450 diilustrasikan terikat pada kamper substrat nya. (Kanan) Pada situs aktif, substrat dikelilingi oleh residu dari enzim. Perhatikan juga adanya kofaktor heme.

3. Karakteristik spektroskopi dari perubahan banyak enzim dan substrat pada pembentukan kompleks ES. Ini perubahan yang sangat mencolok jika enzim mengandung kelompok prostetik berwarna. Triptofan sintetase, suatu bakteri enzim yang mengandung fosfat piridoksal (PLP) kelompok prostetik, memberikan ilustrasi yang bagus. Enzim ini mengkatalisis sintesis l-triptofan dari l-serin dan turunan indole. Penambahan L-serin untuk enzim menghasilkan peningkatan fluoresensi kelompok PLP (Gambar. 6). Penambahan berikutnya pada indole, yang substrat kedua, mengurangi fluoresensi ke tingkat yang lebih rendah dari enzim saja. Jadi, spektroskopi fluoresensi mengungkapkan adanya sebuah kompleks enzim-serin dan kompleks enzim-serin-indol. Lain spektroskopi teknik, seperti resonansi magnetik nuklir (NMR) dan resonansi spin elektron (SEM), juga sangat informatif tentang gambaran interaksi ES.

Gambar. 6. Perubahan spektroskopi Karakteristik dengan Pembentukan sebuah Kompleks Enzim-Substrat. Intensitas fluoresensi kelompok fosfat piridoksal di situs aktif perubahan sintetase triptofan pada penambahan serin dan indole, substrat.

3.2. Situs aktif Enzim Memiliki Beberapa Fitur Umum

Situs aktif enzim adalah daerah yang mengikat substrat (dan kofaktor, jika ada). Hal ini juga berisi residu yang secara langsung berpartisipasi dalam membuat danmemutuskan ikatan. Residu ini disebut kelompok katalitik. Pada dasarnya, interaksi antara enzim dan substrat di situs aktif mempromosikan pembentukan keadaan transisi. Situs aktif adalah wilayah enzim yang paling langsung menurunkan ΔG reaksi, yang menghasilkan peningkatan tingkat karakteristik aksi enzim. Meskipun enzim berbeda dalam struktur, spesifisitas, dan modus katalisis, sebuah jumlah generalisasi tentang situs aktif mereka dapat dinyatakan: sebagai berikut:

1.      Situs aktif adalah tiga-dimensi yang dibentuk oleh kelompok-kelompok cacat yang berasal dari bagian-bagian yang berbeda dari urutan asam amino, residu dalam urutan jauh dapat berinteraksi lebih kuat dari residu yang berdekatan di urutan asam amino. Dalam lisozim, enzim yang mendegradasi dinding sel dari beberapa bakteri, yang penting kelompok situs aktif merupakan kontribusi dari residu bernomor 35, 52, 62, 63, 101, dan 108 dalam urutan 129 asam amino (Gambar. 7).

Gambar. 7. Situs Aktif bisa Sertakan Residu Jauh. (A) Pita diagram lisozim enzim dengan beberapa komponen dari situs yang aktif ditampilkan dengan warna. (B) Representasi skematik dari struktur utama lisozim menunjukkan bahwa situs aktif terdiri dari residu yang datang dari berbagai bagian dari rantai polipeptida.

2. Situs aktif mengambil bagian yang relatif kecil dari total volume enzim. Sebagian besar residu asam amino dalam enzim tidak dalam kontak dengan substrat, yang menimbulkan pertanyaan menarik tentang mengapa enzim yang begitu besar. Hampir semua enzim terdiri dari lebih dari 100 residu asam amino, yang memberikan mereka massa yang lebih besar dari 10 kd dan diameter lebih dari 25 Å. "ekstra besar" asam amino berfungsi sebagai perancah untuk membuat situs tiga-dimensi aktif dari asam amino yang jauh terpisah dalam struktur primer. Asam amino dekat satu sama lain dalam struktur primer sering dibatasi sterik dari mengadopsi hubungan struktural yang diperlukan untuk membentuk situs aktif. Dalam banyak protein, yang asam amino tersisa juga merupakan situs regulasi, situs interaksi dengan protein lain, atau saluran untuk membawa substrat dengan situs aktif.

3. Situs aktif celah atau celah-celah. Dalam semua struktur yang dikenal enzim, molekul substrat terikat ke bagian cacat atau celah. Air biasanya dikecualikan, kecuali air itu adalah reaktan. Karakter nonpolar dari banyak celah meningkatkan pengikatan substrat serta katalisis. Namun demikian, celah juga dapat mengandung residu polar. Dalam mikro nonpolar dari situs aktif, tertentu residu ini polar memperoleh sifat khusus penting untuk ikatan substrat atau katalisis. Posisi internal dari residu kutub adalah pengecualian biologis penting untuk aturan umum
bahwa residu kutub terkena air.

4. Substrat terikat enzim oleh atraksi beberapa yang lemah. ES kompleks biasanya memiliki konstanta kesetimbangan yang berkisar 10^-2 sampai 10^-8 M, sesuai dengan energi bebas dari interaksi mulai dari sekitar -3 hingga -12 mol kkal^-1 (dari -13 sampai -50 kJ mol-¹). Interaksi nonkovalen di kompleks ES jauh lebih lemah daripada ikatan kovalen, yang telah
memiliki energi antara -50 dan -110 kkal mol^-1 (antara -210 dan -460 kJ mol^-1). interaksi elektrostatik, ikatan hidrogen, van der Waals, dan interaksi hidrofobik memediasi secara reversibel interaksi dari biomolekul. Van der Waals menjadi signifikan dalam mengikat hanya ketika atom substrat banyak bersamaan datang dekat dengan atom yang banyak enzim. Oleh karena itu, enzim dan substrat harus saling melengkapi bentuk. Karakter arah ikatan hidrogen antara enzim dan substrat sering memberlakukan tingkat spesifisitas tinggi, seperti yang terlihat dalam ribonuklease enzim RNA-degrading (Gambar. 8).

Gambar. 8. Ikatan Hidrogen antara enzim dan substrat. Enzim ribonuklease membentuk ikatan hidrogen dengan komponen uridin substrat. [FM Richards, HW Wyckoff, dan N. Allewel. Dalam The Neurosciences: Second Study Program, F. O. Schmidt, Ed. (Rockefeller University Press, 1970), p. 970.

5. Kekhususan mengikat tergantung pada pengaturan tepat didefinisikan atom dalam sebuah situs aktif. Karena enzim dan substrat berinteraksi dengan cara kekuatan jarak pendek yang memerlukan kontak dekat, substrat harus memiliki kecocokan bentuk yang sesuai ke dalam situs. Analogi Emil Fischer dari kunci dan kunci (Gambar. 9), dinyatakan pada tahun 1890, telah terbukti menjadi sangat bermanfaat. Namun, kita sekarang tahu bahwa enzim yang fleksibel dan bahwa bentuk situs aktif dapat nyata dimodifikasi oleh pengikatan substrat, seperti yang didalilkan oleh Daniel E. Koshland, Jr, pada tahun 1958. Situs aktif dari beberapa enzim mengasumsikan bentuk yang melengkapi bahwa keadaan transisi hanya setelah substrat terikat. Proses pengakuan dinamis disebut induced fit (cocok diinduksi) (Gambar. 10).

Gambar. 9. Model Kunci-dan-kunci Enzim-Substrat Binding. Dalam model ini, situs aktif enzim terikat bersifat komplementer dalam bentuk ke substrat.

Gambar. 10. Model Diinduksi-Fit Enzim-Substrat Binding. Dalam model ini, perubahan bentuk enzim pada substrat yang mengikat. Situs aktif membentuk bentuk komplementer untuk substrat hanya setelah substrat telah terikat.

8.4. Model Michaelis-Menten Account untuk sifat kinetik banyak enzim

Fungsi utama dari enzim adalah untuk meningkatkan tingkat reaksi sehingga mereka kompatibel dengan kebutuhan organisme. Untuk memahami bagaimana fungsi enzim, kita perlu deskripsi aktivitas kinetik mereka. Bagi banyak enzim, yang tingkat katalisis V₀, yang didefinisikan sebagai jumlah mol produk yang terbentuk per detik, bervariasi dengan substrat konsentrasi [S] dengan cara yang ditunjukkan pada Gambar. 11. Tingkat katalisis meningkat secara linear seiring dengan peningkatan konsentrasi substrat dan kemudian mulai tingkat berhenti dan pendekatan maksimal pada konsentrasi substrat yang lebih tinggi. Pertimbangkan sebuah enzim yang mengkatalisis S ke P oleh jalur berikut:

Tingkat pembentukan produk ditentukan sebagai fungsi waktu untuk serangkaian konsentrasi substrat (Gambar. 12). Seperti yang diharapkan, dalam setiap kasus, jumlah produk yang terbentuk meningkat seiring dengan waktu, walaupun akhirnya waktu tiba saat tidak ada perubahan bersih dalam konsentrasi enzim S atau P. Enzim masih aktif mengubah substrat menjadi produk dan visa versa, tapi kesetimbangan reaksi telah dicapai. Gambar. 13A menggambarkan perubahan konsentrasi yang diamati dalam semua peserta reaksi dengan waktu sampai kesetimbangan tercapai.

Gambar. 11. Kinetika Michaelis-Menten. Sebuah plot dari kecepatan reaksi (V₀) sebagai fungsi dari konsentrasi substrat [S] untuk enzim yang mematuhi kinetika Michaelis-Menten menunjukkan bahwa kecepatan maksimal (V maks) adalah mendekati asimtotik. Para Michaelis konstan (KM) konsentrasi substrat menghasilkan kecepatan V maks / 2.

Gambar. 12. Menentukan Kecepatan Awal. Jumlah produk yang terbentuk pada konsentrasi substrat yang berbeda diplot sebagai fungsi waktu. Kecepatan awal (V₀) untuk setiap konsentrasi substrat ditentukan dari kemiringan kurva pada awal reaksi, ketika reaksi sebaliknya tidak signifikan.

Gambar.13. Perubahan Konsentrasi Peserta Reaksi dari Reaksi Enzim-Dikatalisis dengan waktu. Konsentrasi perubahan di bawah (A) kondisi keadaan yang mantap (steady-state), dan (B) pra-kondisi stabil.

Kinetika enzim lebih mudah didekati jika kita dapat mengabaikan reaksi kembali. Bisa didefinisikan V₀ sebagai tingkat kenaikan produk dengan waktu ketika [P] rendah, yaitu pada waktu mendekati nol (karenanya, V₀) (Gambar. 13B). Jadi, untuk grafik di Gambar. 11, V₀ adalah ditentukan untuk masing-masing konsentrasi substrat dengan mengukur laju pembentukan produk pada masa awal sebelum P terakumulasi (lihat Gambar. 12).

Kita mulai pemeriksaan kinetik aktivitas enzim dengan grafik yang ditunjukkan pada Gambar. 11. Pada konsentrasi tetap enzim, V₀ adalah hampir linear sebanding dengan [S] saat [S] adalah kecil tetapi hampir independen dari [S] dan saat [S] adalah besar. Pada tahun
1913, Leonor Michaelis dan Maud Menten mengusulkan sebuah model sederhana untuk menjelaskan karakteristik kinetik. fitur penting dalam penambahan mereka adalah bahwa kompleks ES tertentu adalah antara yang diperlukan dalam katalisis. Model diusulkan, yang merupakan salah satu account yang sederhana untuk sifat kinetik dari banyak enzim, adalah

sebuah enzim E menggabungkan dengan substrat S untuk membentuk sebuah kompleks ES, dengan laju yang konstan k 1. Kompleks ES memiliki dua kemungkinan. Hal ini dapat memisahkan E dan S, dengan laju yang konstan k -1, atau dapat melanjutkan untuk membentuk produk P, dengan tingkat yang konstanta k 2. Sekali lagi, kita asumsikan bahwa hampir tidak ada produk beralih ke substrat awal, suatu kondisi yang berlaku dalam tahap awal dari reaksi sebelum konsentrasi produk yang cukup.

 Kami ingin ekspresikan yang berhubungan dengan tingkat katalisis untuk konsentrasi substrat dan enzim dan tingkat dari langkah-langkah individu. Titik awal kami adalah bahwa tingkat katalitik sama dengan produk dari konsentrasi kompleks ES dan k2.

Sekarang kita perlu untuk mengekspresikan [ES] dalam hal jumlah yang diketahui.

Tingkat pembentukan dan pemecahan ES diberikan oleh: Untuk menyederhanakan masalah, kita akan bekerja di bawah asumsi kondisi stabil. Dalam kondisi stabil, konsentrasi intermediet, dalam hal ini [ES], tetap sama bahkan jika konsentrasi bahan awal dan produk berubah. Ini terjadi ketika tingkat pembentukan dan kerusakan kompleks ES adalah sama. Mengatur sisi kanan persamaan 11 dan 12 sama menghasilkan:

dengan menata ulang persamaan 13, kita memperoleh

Persamaan 14 dapat disederhanakan dengan mendefinisikan sebuah konstanta baru KM, disebut konstanta Michaelis:

Perhatikan bahwa K M memiliki satuan konsentrasi. KM adalah karakteristik penting dari interaksi enzim-substrat dan independen dari enzim dan konsentrasi substrat.

Memasukkan Persamaan 15 ke dalam persamaan 14 dan pemecahan untuk [ES] akan menghasilkan

Sekarang marilah kita memeriksa pembilang dari persamaan 16. Konsentrasi substrat bentuk bebas [S] sangat hampir sama dengan konsentrasi total substrat, asalkan bahwa konsentrasi enzim jauh lebih rendah dibandingkan dengan substrat. konsentrasi enzim bentuk bebas [E] adalah sama dengan konsentrasi enzim total [E] T dikurangi konsentrasi ES kompleks.

Mensubstitusi ungkapan ini untuk [E] dalam persamaan 16 memberikan

Memecahkan persamaan 18 untuk [ES] memberikan

Atau

Dengan mengganti ungkapan ini untuk [ES] ke dalam persamaan 10, kita memperoleh

Tingkat maksimal, V_max, dicapai ketika situs katalitik pada enzim jenuh dengan substrat yaitu ketika [ES] = [E]_T. Jadi,

Dengan mensubstitusi persamaan ke dalam persamaan 21 menghasilkan persamaan 22 Michaelis-Menten:

Persamaan ini untuk data kinetik diberikan pada Gambar. 11. Pada konsentrasi substrat yang sangat rendah, ketika [S] jauh kurang dari KM, V₀ = (V_maks / KM) [S], yaitu, angka ini berbanding lurus dengan konsentrasi substrat. Pada tinggi konsentrasi substrat, ketika [S] jauh lebih besar dari KM, V₀ = V_max, yaitu, angka ini maksimal, independen dari konsentrasi
substrat.

Arti K M terbukti dari persamaan 23. Ketika [S] = K M, maka V₀ = V_maks / 2. Jadi, K M adalah sama dengan konsentrasi substrat di mana laju reaksi setengah nilai maksimal nya. K M adalah karakteristik penting dari reaksi katalis signifikan enzim dan untuk fungsi biologisnya.
Konsekuensi fisiologis KM digambarkan oleh sensitivitas dari beberapa individu untuk etanol. Seperti orang menunjukkan kemerahan pada wajah dan denyut jantung yang cepat (takikardia) setelah menelan bahkan sejumlah kecil alkohol. Dalam hati, alkohol dehidrogenase mengubah etanol menjadi asetaldehida.

Biasanya, asetaldehida, yang merupakan penyebab dari gejala-gejala ketika hadir pada konsentrasi tinggi, diproses untuk asetat oleh dehidrogenase asetaldehida.

Kebanyakan memiliki dua bentuk dehidrogenase asetaldehida, bentuk KM rendah mitokondria dan sitosol bentuk KM tinggi. Pada posisi yang rentan, enzim mitokondria kurang aktif karena substitusi asam amino tunggal, dan asetaldehida hanya diproses oleh enzim sitosol. Karena enzim ini memiliki KM yang tinggi, asetaldehida kurang diubah menjadi asetat; asetaldehida kelebihan lolos ke dalam darah dan rekening untuk efek fisiologis.